克隆化的方法很多,常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。
1.有限稀释法克隆
(1)克隆前1天制备饲养细胞层(同细胞融合)。
2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干,计数。
(3)调整细胞为3~10个细胞/ml。
(4)取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板,每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%二氧化碳培养箱中 。
(5)在第7天换液,以后每2~3天换液1次。
(6)8~9天可见 细胞克隆形成,及时检测抗体活性。
(7)将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
(8)每个克隆应尽快冻存。
2.软琼脂培养法克隆
(1)软琼脂的配制:含有20%ncs(小牛血清)的2倍浓缩的rpmi1640。
①1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。
②0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的rpmi1640配制而成。置42℃保温。
(2)用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。
(3)按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
(4)1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
(5)混匀后立倾注于琼脂基底层上,在室温中10min,使其凝固,孵育于37℃、5%二氧化碳培养箱中。
(6)4~5天 后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。
(7)检测抗体,扩大培养,必要是地再克隆化。